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液相色譜儀HPLC 測定玫瑰花中原花青素B2 的含量
更新時間:2016-02-17   點擊次數(shù):3167次

1 實驗儀器和材料

1.1 儀器

RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;UV-752N 紫外分光光度計;Agilent1260 液相色譜儀;色譜柱:Phenomenex Luna (250 mm×4.6 mm,5 μm)C18柱;AB- 8 型大孔樹脂;梅特勒電子天平。

1.2 材料

干玫瑰花,平陰產(chǎn)豐花;原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)> 95%);甲醇(一級色譜純);實驗用水為娃哈哈純凈水;其余化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Luna250mm×4.6 mm5μmC18柱;流動相:2%冰醋酸水溶液甲醇,梯度洗脫,洗脫時間程序見表1;進樣量:20 μl;檢測波長:280 nm;流速:1 ml·min-1;柱溫:30 ℃。色譜圖見圖12

 

2.2 實驗方法

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品5.14 mg, 置10 ml 的容量瓶中, 加甲醇稀釋至刻度,配制成514 μg·ml-1 的原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,再精密吸取1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml 的原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,用甲醇稀釋到10 ml,配成51.4μg·ml-1、77.1 μg·ml-1、102.8 μg·ml-1、128.5 μg·ml-1、154.2 μg·ml-1 的原花青素B2的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用裝有0.22μm 微孔濾膜的濾器進行過濾,棄去初濾液,即得。

2.2.2 樣品溶液的制備

精密稱取1.0 g 玫瑰花粉末, 以60%乙醇作為溶劑, 以40∶1 的液料比, 在30 ℃條件下超聲提取10 min,抽濾,低溫減壓蒸發(fā)濃縮,濃縮液溶于蒸餾水得原花青素B2粗提物。然后在處理好的AB-8 型大孔樹脂的層析柱(20 cm×1 cm)上樣,上樣量為25 ml,上樣后先用3BV 的蒸餾水洗至洗脫液無色,再用3BV40%的乙醇洗脫,洗脫速度為1 ml·min-1,收集洗脫液,將洗脫液低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,將洗脫液蒸干后用甲醇稀釋溶解定容到10 ml, 制成經(jīng)大孔樹脂吸附純化后的玫瑰花原花青素B2的提取物。用裝有0.22 μm 微孔濾膜的濾器進行過濾,棄去初濾液,備用。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

取上述標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各20 μ進樣,測得峰面積,以原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(Y)對于濃度(X)進行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=5.3277X+5.9613R2=0.9998。在51.4154.2 μg·ml-1 范圍內(nèi),對照品濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系,見圖3

 

 

2.2.4 精密度試驗

取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液(102.8 μg·ml-1),重復(fù)進樣5 次,測得其峰面積,RSD=0.29%。測定結(jié)果表明精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗

取制備好的樣品溶液的續(xù)濾液20 μl 連續(xù)進樣5 次,測得峰面積,RSD=1.47%。測定結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗

取上述對照品溶液(102.8 μg·ml-1),分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h,測定1 次,計算其峰面積的RSD(n=5)為0.49%。結(jié)果表明對照品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.7 回收率

準(zhǔn)確加入已知濃度原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品2.5 ml,再準(zhǔn)確加入相同濃度的原花青素B2標(biāo)準(zhǔn)品2 ml,甲醇定容至10 ml,用裝有0.22μm 微孔濾膜的濾器進行過濾,棄去初濾液,取20 μl 續(xù)濾液以備進樣,測得峰面積,代入回歸方程,求得相對應(yīng)的原花青素B2的濃度。結(jié)果平均回收率為98.35%,RSD=1.24%(n=5) 。

2.2.8 樣品含量測定

各樣品按2.2.2 項下制備成供試液,按2.1 色譜條件下測定其峰面積,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中原花青素B2的含量,結(jié)果見表2。

 

 

3 討論

本實驗運用HPLC 法對玫瑰花原花青素提取物進行了定性定量分析。結(jié)果顯示:玫瑰花原花青素提取物中存在原花青素B2,且分析了山東產(chǎn)地的11個品種的玫瑰花含量,其中豐花的含量zui高,紫枝的含量zui低。結(jié)果為:標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5.3277X+5.9613,R2=0.9998,在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為51.4~154.2 μg·ml-1 范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。回收率為98.35%(n=5)。zui低檢出限為3.212 μg·ml-1,結(jié)果顯示該方法適合用于分析玫瑰花原花青素提取物。為今后考察各產(chǎn)地和全國范圍內(nèi)的玫瑰花原花青素B2的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)和實驗參考資料。

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