1實驗部分
1.1材料、儀器及試劑
供試材料16個,由中國農業科學院油料作物研究所提供,其中穩定的品種及品系材料13個,分別為中油821、1008、5899、6098、M1、R1、R6、168、H8003、8908、8007、TR008和Y001,F1代材料3個分別為6098/1008、6098/M1和5899/1008。薹期取10個單株第3、4片新葉混合,保鮮袋密封保存于-45°C低溫冰箱冰凍干燥20h,貯存于-40°C低溫冰箱備用。
MODULOD2230冰凍真空干燥儀;電熱鼓風熱干燥箱;DW2FL135低溫冰箱;KQ2800KDE型超聲波清洗器和SigmaZK15冷凍離心機。waters液相色譜系統,510型梯度泵,470型自動進樣器,2487型紫外檢測器,檢測波長229nm,NovapakC18色譜柱,柱溫30°C,進樣量10μL,流動相流速為1mL/min,洗脫液為100%水-20%乙腈梯度洗脫。
實驗所用試劑均為色譜純,丙烯基硫甙和苯甲基硫甙標準樣品購自Sigma公司。
1.2實驗方法
1.2.1葉片硫甙含量計算
根據慣例測定結果采用丙烯基硫甙或苯甲基硫甙作為色譜內標物根據保留時間對硫甙進行定性、定量,以每克葉片干粉所含硫甙微摩爾數表示(μmol/g),硫甙分量計算公式如下:
式中,G.硫甙分量;Ag.脫硫硫甙峰面積的數值;As.標準脫硫硫甙峰面積的數值;Kg.脫硫硫甙相對校正系數;m.試樣質量的數值,單位為g;n.加入標準物質的量,單位為μmol。
1.2.2樣品前處理方法
分別采用液氮、電熱鼓風熱干燥和冰凍干燥3種不同方法處理供試材料,確定試驗*的干燥方法。
準確稱取01200g粉碎樣品于10mL聚丙烯圓底離心管中,75°C水浴殺活1min,加70%(φ)甲醇2mL,內標200μL(不含丙烯基的樣品加丙烯基為內標,否則加苯甲基為內標)渦旋混合,分別用超聲波提取、75°C水浴提取和高速旋轉勻漿機3種提取方式進行提取。
1.2.3HPLC色譜條件
本實驗采用液相色譜分離梯度洗脫。流動相A:100%水;流動相B:20%乙腈。0～10min,A為85%～0;10～12min,A為0;12～15min,A為0～85%。流速1mL/min。
1.2.4葉片硫甙回收率和方法精密度實驗
用高、中、低硫甙3種甘藍型油菜葉片進行苯甲基硫甙標準樣品加標回收率實驗。對油菜葉片樣品進行10次重復測定,計算極差和相對標準偏差,確定油菜葉片測定方法的精密度。
2結果與討論
2.1葉片樣品干燥前處理方法與檢測結果
油菜葉片為鮮活樣品,其硫甙含量與組分分析有特殊性,與種子中硫甙測定不同,當油菜葉片組織被機械損傷或受到病蟲害侵襲時,可引起葉片硫甙含量急劇變化。實驗分析了液氮、加熱干燥和冰凍干燥3種方法對油菜葉片中硫甙含量測定結果的影響,結果表明:液氮處理樣品的測定結果較好,但操作復雜,不適用于大批量樣品分析。加熱干燥處理樣品過程中因部分硫甙降解,造成測定結果偏低。冰凍干燥測定結果準確,檢測靈敏度高,分析效率高,可操作性強,適于批量樣品處理分析。因此實驗采用冰凍干燥方法進行油菜葉片樣品前處理。
2.2葉片硫甙提取技術與檢測結果
以超聲波、75°C水浴和高速旋轉勻漿機不同的提取硫甙方式進行提取效率比較,結果見表1。由結果可以看出:水浴方法提取時間較長,且硫甙含量的測定結果偏低;高速旋轉勻漿機提取使結果顯著低于其它兩種提取方式;超聲波提取具有提取率高、時間短、對提取成分影響小、重復性好等優點,用于油菜葉片中硫甙的提取,可以節約分析時間,簡化操作,提高工作效率。
2.3葉片硫甙含量的加標回收率
選取葉片硫甙含量不同的甘藍型油菜樣品,添加苯甲基硫甙標準樣品,進行加標回收試驗,結果見表2。不同葉片硫甙總量水平下,分別加入015、510和1010μmol標準樣品,油菜葉片硫甙加標回收率均達94%以上,且結果穩定,回收率變化范圍為94%～103%,表明該方法準確可靠。
2.4方法精密度實驗
對相同油菜葉片樣品10次重復處理。測定均值為8138μmol/g,極差為2129μmol/g。每個樣品值與均值之偏差均小于2μmol/g,極差小于3μmol/g,誤差在油菜種子硫甙測定標準(ISO9167:1-1992)規定范圍之內,RSD為8112%,表明該方法重復性較好。
2.5不同油菜葉片硫甙含量與成分分析
用建立的油菜葉片硫甙總量與分量測定方法,對芥菜型、白菜型和甘藍型油菜薹期葉片進行分析,具體結果見表3及圖1～3。
不同類型油菜品種,其薹期葉片硫甙含量不同,各組分在3類油菜葉片中差異很大。芥菜型油菜葉片僅含有丙烯基硫甙和32丁烯基硫甙兩種組分,但含量較高,分別為8196μmol/g和5140μmol/g;白菜型油菜葉片主要含32丁烯基硫甙、32吲哚甲基硫甙和42戊烯基硫甙,且3種組分含量都較低,分別為0130、1179和0125μmol/g;甘藍型油菜葉片含較多硫甙組分,其中以22羥基232丁烯基硫甙、32丁烯基硫甙和吲哚類硫甙為主,含量分別為7121、4103和2169μmol/g。
前人研究結果表明，油菜種子中硫甙芥菜型以丙烯基硫甙為主;白菜型以32丁烯基硫甙和42戊烯基硫甙為主;甘藍型以22羥基232丁烯基硫甙、32丁烯基硫甙和42戊烯基硫甙為主。可見,不同類型油菜中,葉片硫甙與種子硫甙的主要組分不盡一致,關于兩者之間的關系有待于進一步系統研究。本試驗油菜葉片硫甙與組份測定HPLC方法的建立,為油菜定向雜交育種與抗性品種選育提供了檢測手段支持。
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